hMeDIP-qPCR

  • 简介
  • 技术难点
  • 技术服务流程
  •        实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative PCR)是在PCR反应体系当中加入荧光试剂,利用荧光信号积累实时检测PCR的进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR能够专一,灵敏,快速,高重复地精确定量起始模板的浓度。
           Aksomics(原康成生物)将实时定量PCR技术与hMeDIP技术完美结合。首先通过hMeDIP技术富集甲基化的DNA片段,然后利用实时定量PCR技术进行检测,最后经过数据分析处理得到检测的生物样品中特定位点的甲基化水平的精确数值。

  • ? 高特异性,针对感兴趣的基因启动子或CpG岛设计实时定量PCR引物
    ? 超宽的线性范围,可跨越7个数量级
    ? 精确度高,重复性好
    ? 灵敏度高 

  • A. 将基因组DNA 超声打断成400bp-500bp片段
    B. 加热变性,并将变性后的单链DNA样品分为两份
    C. 其中一份单链DNA样品加入抗5’-羟甲基胞嘧啶抗体,另一份作为Total input DNA样品
    D. 使用亲和层析分离C步样品中的羟甲基化DNA片段的抗体复合物,样品中其余的非羟甲基化DNA片段被洗脱。纯化得到羟甲基化DNA片段(hMeDNA-IP DNA)
    E. 实时定量PCR检测 


    数据处理

    ?  Total input DNA样品作为模板,用待测基因特异性引物进行qPCR检测得到Ct (input)
    ?  hMeDNA-IP DNA样品作为模板进行检测得到Ct (IP)
    ?  待测基因甲基化DNA免疫沉淀(hMeDIP)的效率(hMeDIP / Total input)可通过以下公式计算:
       %(hMeDIP / Total input)= 2^[ Ct (input)- Ct (IP) ] X 100